hisat2和bowtie2(dna是什么意思啊)

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大家好，今天来介绍hisat2和bowtie2(hisat2建立索引需要多久)的问题，以下是渲大师小编对此问题的归纳和整理，感兴趣的来一起看看吧！

DNA/RNA序列比对软件整理

文章仅是记录自己的学习使用，有错误请指出，我立刻改正

在对比对工具进行比较时，通常将其分为DNA比对工具（DNA-seq）和RNA比对工具（RNA-seq）。它们的区别在于是否会考虑跨外显子的比对，即：是否会将没有比对上的reads劈开，对劈开后的两部分再次比对）。
随着现在各种seq测序的出现，我们已经不能简单的根据是比对DNA还是RNA来判断。比对工具的选择主要依据reads的比对是否需跨外显子。（PRO-seq/GRO-seq，它们虽然在建库时捕获的RNA，但是它们的比对并不需要考虑跨外显子。）

常用工具：
DNA-seq：BWA；bowtie&bowtie2
RNA-seq：STAR；HISAT2；Tophat&Tophat2

BWA主要应用二代测序后的大量短小片段与参考基因组之间的定位比对。需要先嫌燃对参考序列建建立索引，BWA也是基于 BWT和 FM-Index 理论来对参考基因组做索引。根据测序方法的不同，有单末端序列(Single-end，SE)比对和双末端序列(Pair-end，PE)比对。

bowtie出现在测序行业还不成熟的时候，序列长度普遍在50bp以下，bowtie的只满足长度在50bp以下的reads的比对。官方称其可以把短的DNA序列（35bp）快速的比对到人类基因组上。
Bowtie2 是一款经典的短读长序列（ 50-100 bp，最多可到1000 bp ) 比对软件，节约内存且灵活与成熟的短序列比对软件，比较适合下一代测序技术。支持单端测序（unpaired) 和双端测序的比对。支持全局比对（end-to-end align ) 和 局部比对( local align )。其通常使用全文分索引(FM-index)以及Burrows-Wheeler 变换(BWT)索引基因组使得比对非常快速且内存高效，但是这种方法不适合于找到较长的、带缺口的序列比对
结论：bowtie和bowtie2，是两个不同类型的比对工具，bowtie2并非是bowtie的升级。尺有所长寸有所短，bowtie适合长度在50b长度以内的reads比对，而bowtie2适合50-100b，甚至更长的reads比对。但是这两个都属DNA-seq比对工具

RNA-Seq测序的特性，天然的会有一部分数据延伸到内含子区，这部分跨越外显子和内含子的reads就称为『junction reads』，所以RNA-Seq比对软件需要针对此进行优化。
（ junction：转录组reads比对不同于基因组reads比对(如ChIP-seq、WES等)的地方在于，比对的reads可能来源于2个被内含子隔开的外显子区域，导致reads一端比对在第一个外显子的后面部分，另一端比对在第二个外显子的前面部分，芹衡虚即跨剪切位点，从而形成exon-exon junction (剪接点)。这些reads又称为junction reads，对转录本的拼接、鉴定和差异分析具有重要的意义。）
（soft-clip事件: 即reads末端存在低质量碱基或接头导致比对不上的， STAR会自动尝试截去未比对部分，只保留比对上的部分。）

STAR是ENCODE皇家御用的RNA-seq比对工具，ENCODE计划(ENCyclopedia Of DNA Elements)又称人类基因组DNA元件百科全书计划，是2003年在人类基因组计划完成之后紧接着的又一个大型国际科研项目。

Tophat2的原作者们也不知道是出于什么考虑，不再更新Tophat2，转而开发了一个新的比对工具HISAT2，更是推荐人们使用HISAT2，声称其速度更快，内存占用率更小，准确率更高。
此外，HISAT2不仅支持RNA-seq的比对还支持DNA-seq比对，唯一需要做的就是加上一个参数--no-spliced-alignment。但是就目前拦散来看，大部分人都是使用HISAT2做RNA-seq，没人使用它做DNA-seq

Tophat/Tophat2工具本身不能进行比对，它是通过调用bowtie/bowtie2进行比对的。划重点，bowtie2不是bowtie的升级版，但是Tophat2是Tophat2的升级版。因此Tophat只可以调用bowtie，而Tophat2不仅可以调用bowtie2（默认）还可以更改设置调用bowtie。
Tophat/Tophat2调用bowtie/bowtie2后，会首先使用bowtie/bowtie2对序列进行比对，对于那些没有比对上的，会考虑其跨外显子的可能性，将reads劈开重新比对。

全长转录组（Full-length transcriptome）是基于PacBio和Nanopore三代测序平台，无需打断拼接，直接获得包含5’UTR、3’UTR、polyA尾的mRNA全长序列及完整结构信息，从而准确分析有参考基因组物种可变剪接及融合基因等结构信息，克服无参考基因组物种转录本拼接较短、信息不完整的难题。同时还可以借助二代测序数据，进行转录本特异性表达分析，获得更加全面的注释信息。

传统的使用比较多的长读长比对软件是GMAP，05年发表公布，最开始是用来比对低通量的est序列的，后来也有进一步升级为GSNAP支持高通量的二代测序。PacBio测序技术出现后，常用于Iso-seq转录本的鉴定，目前仍是相关研究引用量最高的比对软件，该软件也一直在持续更新升级。其可以将转录本序列与参考基因组序列比对，输出gff文件，比对速度稍慢。

Minimap2是生信大牛李恒18年用C语言开发的可以用于三代数据（subreads、iso-seq）比对的长序列比对软件，与传统的三代比对工具GMAP相比，其速度有非常显著的提升，当然同时消耗的内存也比较大。使用方法也比较简单，近几年引用次数增长的也很迅速，所以大家可以试试用minimap2进行Iso-seq的比对。

HISAT2 建立索引警告和比对时报错解决方案

tags： HISAT2 RNA-seq

HISAT2 发表的文章中强调了它的速度很快，我就测试了一下这个工具。

HISAT2 建立索引：

然而没多久就看到这样的警告：

只是警告，并没有报错。

HISAT2 建参考索引很慢，等 HISAT2 建完索引（建索引花了 16 个小时），然后用 HISAT2 比对 RNA-seq 数据测试。

几分钟之后报错了：

github 上有人在 HISAT2 项目中报告过这个错误，虽然没有最终讨论出解决办法，但是都觉得跟建索引不完整有关，或许与建索引时候的警告有关。我查了一些资料，综合 biostar 和 SEQanswer 中的讨论，建立索引时遇到的警告是由于参考序列中存在大段的 n 碱基导致的，例如其中一条 fasta 中 n （我遇到的是小写的 n）太多。解决办法也很简单，过滤掉参考序列中长度小于 50bp 的 contig 和序列中连续 n 碱基超过 40bp 的contig 。然后重新建索引，就没有任何警告了，但是会损失部分参考序列。这样处理之后建的索引再睁唤庆用 HISAT2 比对 RNA-seq 数据，就没有问题了。

HISAT2 比对速度确实很快，一个样本转录组数据比对 2G 的核糖体 RNA 参考基因组约 25 分钟，bowtie2 需要 170 分钟（线程数都是 4）。 bowtie2 的 local 模式比对出 21% 的 rRNA 污染链宴，而 HISAT2 比对 2% 的 rRNA 污染，差异也挺大的……

但是，HISAT2 的线程数不能设置太高，用户手册中建议对人类参考基因组进行比对时，线程数设置在 1-8 之间。我用文献悉握 Transcript-level expression analysis of RNA-seq
experiments with HISAT, StringTie and Ballgown 中的数据测试也发现当线程数超过 12 时整个比对步骤消耗的时间反而会增加。

bowtie2可以更改错配碱基数么

1、Sam文件各标签含义（tophat/hisat2）
•NH:i:: N=1时 为unique。常用于tophat/hisat2产生的sam文件unique read筛选。
•CC:Z: 当为‘=’为map到同一条基因上，一般在map基因组时由于内含子存在而容易出现，他只代表两种不同的方式，计数时应记为1。此处一般为其他基因的名字。CP:i 和HI：i标签为map到第i条基因及起始位置。则游
•YT:Z::代表的含义与bowtie产生的sam也不同。具体还未知！其他标签AS，XN,XM,XO,XG,NM,MD等如下图可以看出都相同。
•对于tophat/hisat2比对产生的sam文件我们可以直接筛选NH标签。
grep‘NH:i:1’ out.sam >unique.sam
2、Sam文件各标签含义（bowtie2）
•AS:i:Alignmentscore.可以为负的，在local下可以为正的。 只有当Align≥1 time才出现
•XS:i:Alignmentscorefor second-best alignment. 当Align>1 time出现
•YS:i:Alignmentscorefor opposite mate in the paired-end alignment. 当该read是双末端测序中的另一条时出现
•XN:i:Thenumber of ambiguous bases in the reference covering this alignment.（推测是指不知道错配发生在哪个位置，推测是针对于和缺失，待查证）
•XM:i:错配碱基的数目
•XO:i:Thenumberof gap opens(针对于比对中的和缺失)
•XG:i:Thenumberof gap extensions(针对于比对中的和缺失延伸数目)
•NM:i:Theeditdistance。（edits:/缺失/替换数目)
•YF:Z:该reads被过滤掉的原因。可能为LN(错配数太多，待查证)、NS(read中包含N或者．)、SC(match bonus低于设定的阈值)、QC(failing quality control，待证)
•YT:Z:值为UU表示不是pair中一部分、CP是pair且可以完美匹配、DP是pair但不能很好的匹配、UP是pair但是无法比对到参考序列上。
•MD:Z:比对上的错配碱基的字符串表示。
由于bowtie2产生的sam文件并没有NH标签帆耐，所以提取uniqueread可能比较麻烦。首先提取“AS”标签表示能比对上的read（>=1 time），然后利用grep反正则表达式过态盯春滤掉XS标签得到我们需要的unique read。
grep “AS:” aligned.sam grep –v“XS:” >unique_alignments.sam
对于双端测序用bowtie2比对筛选unique concordant pair时则需要在上一步的基础上增加如下命令：
grep ‘YT:Z:CP’ unique.sam>pair-end_unique.sam
3、Bwa获取unique
samtoolsviewbwa.bam grep "XT:A:U"